Western blot (1)

0. Western blot은 특정 단백질의 유무 또는 양을 알기 위해 수행하는 분석 방법이다.

주로 protein expression, sub-cellular localization (via cell fractionation),

post-translational modifications, protein processing, protein-protein interaction

등을 연구할 때 사용된다.

쉽게 말하면, 특정 유전자가 발현되어 단백질이 생산되었는지 여부와

생산됐다면 얼마나 생산됐는지를 알아보기 위해 정량해보는 실험이다.



1. 이름의 유래는 동서남북 한 과학자의 이름과 장난질에서 유래했다고 한다..

(방향별 쓰임새)

1975년, 영국의 생물학자인 Edwin Southern 이라는 사람이

특정 DNA 서열을 탐지하기 위해 방법을 고안한다.

그래서 그 실험법을 Southern blot이라고 이름지었다.



근데 이름이 이름이었던지라(...) 2년 뒤인 1977년 스탠포드 대학에서

George Stark 외 2명이 RNA 탐지를 위한 방법을 고안해내고

'DNA 다음 RNA니까 이번엔...'이라는 마인드로 이름을 northern blot이라고 짓는다.



그로부터 또 2년 뒤, 1979년,

스와질랜드의 Friedrich Miescher Institute 소속 Neal Burnette가

조직세포 단백질의 분석법을 고안해 western blot이라고 이름 짓는다.



이후에 lipids, phosphates, glycoconjugates, post translational modifications (PTM) 등을

분석하기 위한 용도의 eastern blot까지 등장하면서

분자생물학 실험계의 사방위가 완성된다.

(Antigen-Antibody reaction)

2. 기본 아이디어는 '항원-항체 반응(Antigen-Antibody)'의 결합 특이성이

다른 결합들에 비해 매우 높다는 점에서 착안한다.

Antibody는 특정 antigen의 부위를 특이적으로 인식하고,

그 부위를 epitopes (antigenic determinant)라고 부른다.



3. 단계는 이렇게 구성되어 있다.

Gel electrophoresis : 겔 전기영동. 단백질을 크기별로 분리시키는 젤리.

Transfer : 겔에서 위치별로 분리된 단백질을 필름으로 이동시킴.

Total protein staining : 단백질 염색하기.

Blocking : 항체와 membrane 사이의 상호작용 억제.

Incubation : Membrane에 원하는 항체를 심는 과정.

Detection and visualization : 탐지 및 시각화

Secondary probing : 2차 검증.



4. Gel electrophoresis.

시료의 단백질을 gel electrophoresis를 이용해 분리한다.

Gel electrophoresis (젤 전기영동)은 세포용해물(lysate)처럼 여러 물질이 섞여있을 때

분자량에 따라 분리시키는 방법이다.

(Gel과 전기영동 장치)

겔의 종류로는 agarose, polyacrylamide, starch 등이 있다. 익숙한 것은 가운데의 것..

그래서 PolyAcrylamide Gel Electrophoresis를 PAGE라고 줄여서 쓴다.

보통 5~2000 kDa 정도 범위의 물질들을 분획한다.

Polyacrylamide gel의 조성은 다음과 같다 :

ddH_2O, acrylamide, Tris buffer, SDS, APS, TEMED.

ddH_2O는 double-distilled water로, 흔히 말하는 pure water를 뜻한다. 깨끗하고 비싼 물

(주요 물들의 저항값)

+a : '3차 증류수'라는 말은 없다. 편의를 위해 사용되는 표현법인 것 같은데,

근본적으로 증류수를 사용하는 이유는 '불순물이 섞이지 않은 물'을 사용하고 싶어서이다.

'불순물'은 일반적인 자갈, 모래, 먼지같은 거대입자부터 미생물, 단백질, 이온류까지

광범위한 물질을 일컫고 있다.

이러한 불순물로 인해 물의 전도도(conductivity)가 증가하고, 실험에 오차가 생기게 된다.

흔히 '3차 증류수'라고 말하는 것은 pure water를 지칭하는데,

상온(25°C)에서 18.2 MΩ cm, 혹은 0.055 micro-siemens/cm 정도의 스펙을 갖고 있다.

즉, '불순물이 적어서 전도도가 매우 적은 물'이 초순수 증류수인 것이다.

(영하 12도에서 촬영한 겔의 사진.

위는 겔화 전, 아래는 겔화 후의 모습. 

출처 : 논문)

Acrylamide는 물에 용해시켰을 때 이렇게 카스테라같이 생겼다.

보기와는 다르게 가루일 때와 용액 상태일 때 잠재적인 신경독이 있다고 하니 조심한다.