세포 배양 (1)

1. 배지 만들기

RPMI 1640 한 팩을 autoclave로 멸균한 증류수 1L에 녹여서 사용.

빠져있는 sodium bicarbonate 2g도 추가.

세균 제거를 위해 clean bench에서 필터링을 거침.

최종 농도 1X가 되도록 penicillin-streptomycin을 첨가.

보통 100X antibiotics를 판매하는데, 제품에 따라서는

amphotericin B도 함유되어있어 다세포 진균과 효모까지 억제하기도 함.

냉장 보관(4℃).

일반적으론 RPMI 1640 90~95% + FBS 5~10%의 형태로 사용함.

그래서 FBS 100 mL, antibiotics 10 mL, D.W 890 mL로 섞는다.

주의사항:

RPMI 1640을 이제 막 autoclaving하여 뜨거운 D.W에 넣지 말 것.



2. 세포 분양하기

KCTC나 ATCC 등에서 세포를 받아옴.

나의 경우엔 다른 연구실에서 K562, A549, H727 등을 분양받아옴.

그 중에 H727은 죽었음. 안녕 잘가..

T-Flask에 부착한 A549를 데려왔음.

배지조성은 DMEM 90% + FBS 10% 였다.

기존 배지에서 새로운 배지(RPMI + FBS 10%)로 교체하면

세포들이 깜짝놀라니까 점차적으로 바꿔주는 것도 좋다고 함.

깜짝!



3. 배지 교체하기

기존의 배지 제거.

PBS로 washing 후 PBS 제거. 나는 wasning을 두 번 함.

Trypsin-EDTA 1X를 100Φ petri dish에 1mL 첨가한 후

각 세포의 배양조건(37℃, 5% CO2)에서 3분간 미만 방치한다.

Trypsin-EDTA는 cell junction의 접착력을 약화시켜서

바닥으로부터 혹은 세포들간 부착되어 있는걸 분리시킨다.

잘 안 떼어질 땐 pipetting 해주어서 물리적으로 떼버린다.

Trypsin-EDTA는 세포 독성이 있다고 하니 지나치게 오래 처리하진 말아야 함.

그리고 FBS가 중화 작용을 한다고 함. 그래서

complete media(FBS를 포함하고 있는)를 넣어주는 것이다.

그 다음 centrifugation해서 세포가 가라앉은 pellet을 만든다.

상층액 배지를 제거하고 약 1mL 남짓에 pellet을 풀어준다.

그리고 미리 petri dish에 10mL 정도의 media를 담아둔 다음

위에서 풀어준 진~한 세포액을 이동시켜준다.

잘 풀어서 다시 incubator에 넣어서 키워준다.

밥 다 줬다!



Cell Stock

DMSO 100 uL, FBS 900 uL, pellet 100 uL